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筋細胞に物理的傷害を与えると、ES細胞に似た細胞が出現すると言ふ内容の論文が   西岡昌紀
http://www.asyura2.com/15/nature6/msg/195.html
投稿者 西岡昌紀 日時 2015 年 12 月 09 日 21:46:25: of0poCGGoydL.
 

*
http://mixi.jp/view_diary.pl?id=1948504417&owner_id=6445842

速報です。


まだ良く検討しなければ分かりませんが、本日(2015年12月9日)付けのネイチャー電子版(細胞工学関係)に、筋細胞に物理的傷害を与えると、ES細胞に似た細胞が出現すると言ふ内容の論文が掲載されました。⇒ http://www.nature.com/articles/srep17355


(関連する日本語のサイト)
http://jupiter-press.doorblog.jp/archives/46236779.html

キメラは作れなかったそうですが、物理的刺激でES細胞に似た細胞を誘導する事に成功したと言ふ報告です。


それが、ネイチャーにアクセプトされたのです。


STAP細胞に似て居るではありませんか。

不思議ですね。日本(理研)が、STAP細胞に関する論文を撤回したら、他の国から、こう言ふ論文が出て来たのです。

小保方さんを叩いたマスコミは、ネイチャー電子版にこの様な論文が掲載された事を報道するべきです。


2015年12月9日(水)

西岡昌紀


 

  拍手はせず、拍手一覧を見る

コメント
 
1. 2015年12月11日 00:27:50 : G9lhlpNiJo : QDn1YuUi9gU[2]
「マスコミが叩いた」と思っているのは素人の証拠。
西岡さんには、本件でマスコミからの問い合わせの電話は1本も無かったんだね。
専門家には何本も電話が来たのよ。で、マスコミはその専門家の意見に沿って報道したの。
だから小保方を叩いたのはマスコミではなく専門家。

2. 2015年12月13日 12:37:56 : jXbiWWJBCA : zikAgAsyVVk[136]
http://www.nature.com/articles/srep17355
筋肉由来の幹細胞様細胞の損傷誘発人口のキャラクタリゼーション 
受信:
2015年6月15日
受理:
2015年10月29日
オンラインで公開:
2015年11月27日 
我々は最近、負傷したマウス骨格筋からの幹細胞の新規な集団を発見しました。これらの傷害誘導性の筋肉由来幹細胞様細胞(iMuSCs)は部分的に分化した筋原細胞から再プログラムおよび多能性のような状態を表示しています。このような神経性および筋原分化などの複数の系統に分化する能力を含むiMuSCs展示幹細胞の性質;彼らはまた、in vivoでの筋肉の生着の強力な能力を実証する優れた移行容量を表示します。 IMuSCsには、いくつかの多能性および筋原幹細胞マーカーを発現します。胚様体及び奇形腫を形成する能力を有し、そして3つのすべての胚葉に分化することができます。また、胚盤胞のマイクロインジェクションは、iMuSCsキメラ胚に貢献したが、生殖系列伝達を完了できなかったことを示しました。我々の結果は、iMuSCsが負傷した骨格筋の微小環境によって生成された多能性の部分的に再プログラムされた状態であることを示しています。

導入
損傷後の組織修復は、組織常駐前駆体および幹細胞の活性化、および局所および全身の信号に応答する細胞の浸潤の多様性を含む複雑な生物学的プロセスです。哺乳動物の骨格筋の再生には、筋線維の基底膜と筋細胞膜の間に位置する単核細胞の集団である衛星細胞と筋肉幹細胞(MuSCs)、などの常駐筋前駆cells1,2の活性化および増殖に依存しています。 MuSCsは、細胞の機能的に不均一な集団であり、可変増殖速度、マーカー発現プロフィール、自己再生能力、クローン原性および分化capacities2,3を持っています。我々は以前MuSCsうち、iMuSCsの小集団が存在することを発見した、我々のlaboratory4で確立Cre-loxPシステムを用い、損傷したマウスの骨格筋から単離することができます。我々はiMuSCsは、CD34を発現するのSca1(細胞抗原-1幹)、およびPAX7(ペアボックスタンパク質7)だけでなく、vivo5に強い筋原性分化および筋肉の再生能力を提示するだけでなくことが示されています。さらに、我々はiMuSCsは、細胞の挙動を幹実証し、そのような癒さ骨格muscle4におけるCD31 +内皮様細胞などの非筋原性系統に分化することが可能であることを実証しました。ここでは、さらに、それらの形態、マーカー発現プロフィール、多能性、渡り鳥能力と分化能力に焦点を当て、iMuSCsの特有の性質を調べます。

その結果
我々の確立された細胞分離法(図1a)を適用することによりiMuSCs正常負傷したマウスの前脛骨(TA)筋から単離しました。三日後、細胞単離後、増殖iMuSCs(約全体筋細胞集団の0.1%)を培養皿に現れました。しかし、細胞は、対照から確立された培養物中に存在していない無傷の筋肉(図1b)。顕微鏡評価は、代表iMuSCsは、直径5-7ミクロンであった比較的大きな核と細胞質の狭いリムが含まれていることが明らかになりました。それらの核はMSX1(MSHホメオボックス1)式(補足図S1aと)とヘキスト33342陽性および取り込まれたBrdU(ブロモデオキシウリジン)となりました。たてPAX7とのSca1(図1c)を発現する少数の細胞であったそのうちの陽性細胞を単離し、またはiMuSCsの初期の人口はMSX1およびCXCR4(CXCケモカイン受容体タイプ4)の割合が高いが含まれていました。全体生検負傷したTA筋肉の遺伝子発現分析は、MSX1、(またPOU5F1と呼ばれる)のOct4、Sox2の制御無傷古い脛骨筋(図1dおよび補足図と比較してアップレギュレート(SRYボックス2)およびNanogの発現がありました。S1bが)。新たに単離したiMuSCsは筋原幹細胞関連マーカー、すなわちのSca1、PAX7およびCD34、およびコア多能性マーカー遺伝子、すなわちのOct4、Sox2のおよびNanog発現した(図1E及び補足図。S1cを)。培養iMuSCsは、13時間の平均の細胞集団の倍加時間を有する筋成長培地中でin vitroで増殖させました。細胞遺伝学的解析は、iMuSCsが正常な女性核型を持っていたことを明らかにしました。しかし、染色体異常は、染色体5(補足図S1D)のためのトリソミーで、その結果、長期培養(継代33)の間に現れました。また、iMuSCsが顕著マイグレーション特性を有していたことを発見しました。タイムラプス運動性アッセイからのデータは、iMuSCsは対照マウス筋芽細胞株、C2C12に比べて長く、より高い速度と距離を移行していることを確認し、コントロールから分離しMuSCsは(図1F)筋肉を無傷。また、iMuSCsはmRNAレベル(図1G)でβ-Cateninandいくつかのカドヘリンを高レベルで発現しました。
図1:IMuSCsが幹細胞性表示し、改善された遊走能を発揮します。
 
(a)は、負傷したマウスのTA筋からiMuSCs分離法の概略図。 (b)は非損傷や負傷者の文化の明視野像。 3日細胞の単離後には細胞がコントロール無傷の文化に登場しませんが、iMuSCsが負傷した培養液中に存在していました。 7日の細胞単離後、iMuSCsの増殖が明らかでした。 =10μmのスケールバー。 (C)MSX1(緑)、PAX7(赤)、CXCR4(緑)、iMuSCsののSca1(赤)の発現。核はDAPI(青色)で染色しました。スケールバー=100μmです。 (D)のqPCR全体生検のTA筋の分析、および(e)、新鮮な孤立iMuSCs。 (F)iMuSCsの単一細胞の移動経路、および制御C2C12とMuSCs。タイムラプス運動アッセイで捕捉異なる実験群から20個々の細胞の移行パス。データは3つの独立した実験からプールしました。グラフは、セルの計算された累積距離と速度を示します。データは3生物学的複製から60個々の細胞の平均±SEMとして表されます。 ** P <0.01。 (g)のβカテニン、E-カドヘリン、Mカドヘリン、iMuSCsのN-カドヘリン発現のqPCR分析。データは5生物学的複製の平均±SEMとして表されます。
フルサイズのイメージ
体外多能分化アッセイでiMuSCsはMyHC +(ミオシン重鎖)制御MuSCsとC2C12筋芽細胞(図2a)と同様の融合インデックスを持つ筋分化培地中で筋管と融合することができたことを示しました。 iMuSCsもBMP2と骨形成培地内の骨形成系統(補足図S2)に分化することが可能でした。 iMuSCsも簡単かつ効果的に、一週間のために神経幹細胞培地(方法を参照)で一度培養ニューロスフェアの形成を介して神経性系統に誘導することができた(図2b)、制御一次筋芽細胞およびMuSCsはこれらの構造を形成するの兆候を示さありませんでした。 iMuSCsによって誘発されるニューロスフェアは、神経表現型を示し、ネスチン、CNPアーゼとNefm(ニューロフィラメント)(図2b)を表明しました。 3週間後、神経分化培地にラミニン/ポリオルニチンコーティングした単層培養でメッキ再ニューロスフェアは、三つの主要な神経系統(ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト)に分化することができ、彼らはMtap2を表明し、βチューブリンIII、Nefm 、ネスチンおよびOlig1 / 2(オリゴデンドロサイト転写因子1/2)(図2B、C)。
図2:複数の分化とiMuSCsの筋肉の生着。
 
(a)はiMuSCsの筋管形成を誘導しました。筋管は、MyHC(赤)を表明しました。融合指数は制御C2C12とMuSCsと同様でした。 (b)の代表明視野画像は、懸濁液中に浮遊iMuSCs形成されたニューロスフェアを示しています。凍結切片の神経球の免疫蛍光染色は、ネスチン(緑)、CNPアーゼ(赤)、およびNefm(赤)陽性細胞を示しています。 ND培地にプレーティングし、21日に分化ニューロスフェアは、神経表現型を示します。 β-チューブリンIII(赤)、およびNefm(緑)。核はDAPIで染色しました。スケールバー= 10〜100μmの。 (c)の定量PCRによって分析iMuSCsを分化神経でMtap2とβチューブリンIIIおよびOlig1とOlig2の遺伝子発現動態。データは、未分化iMuSCsと比較した、と5生物学的反復の平均±SEMとして提示されています。筋肉細胞の移植後(D)iMuSCsの生着。染色はユートロフィン+(緑)、ジストロフィン+(赤)の2週間、細胞注射後のmdx / SCIDマウスにおける制御MuSCsとiMuSCsの筋肉の生着を示しています。スケールバー=100μmです。ジストロフィン+筋線維の定量。 ** P <0.01。
フルサイズのイメージ
さらにiMuSCsの起源を調べるために、我々はvivointramuscular移植研究において行いました。 iMuSCsと制御MuSCs同数のは6 6-8週齢の雄のmdx / SCIDマウス(ジャクソン研究所、米国)のTA筋に注射しました。二三週間の細胞移植後、我々はホストのTA筋肉のユートロフィンとジストロフィン(図2d)の発現を検出し、iMuSCs制御MuSCs(図2d)と比較して、より大きく、より強固なジストロフィン+筋肉移植片を形成していることが観察されました。
我々はまた、iMuSCsの遺伝子及びタンパク質発現プロファイルを明らかにするために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)および免疫組織化学分析を行い、胚性幹細胞(ESC)および筋原幹細胞(C2C12及びMuSCs)にこれらを比較しました。 iMuSCsはESCのと同様に、(B、図3a及び補足図のS3a)のOct4、SSEA1(段階特異的胚抗原1)、Sox2の、CXCR4、MSX1、PAX7、とのSca1を発現したが、より低い発現レベルで。 QPCR分析はiMuSCsがESG1及びDAX1(図3B)を除いて、多能性マーカー遺伝子の大部分を発現することを明らかにしました。しかし、ESCは異なり、iMuSCsは筋原性マーカー遺伝子を発現し、興味深いことに、始原生殖細胞関連マーカーの一部、例えばBlimp1とフラジリス、そのようなCD45またはCD90(図3c)として、他の系統に関連した遺伝子を発現しませんでした。また、iMuSCsは、アルカリホスファターゼ(図3a)に対して陽性でした。これらの結果は、彼らが筋原性メモリ(ESCのに比べて、筋原性遺伝子の例えば、高発現を維持するため、iMuSCsは、に似ていますが、ESCのと同じではないことを示し、容易にin vitroで筋原系統に分化するように誘導され、生体内で)。
図3:骨格筋損傷誘発性iMuSCsは、多能性のいくつかのin vitroでの基準を満たします。
 
(a)は、SSEA1(赤)のOct4(緑色)を発現iMuSCsの代表的な免疫蛍光画像、Sox2の(赤)、CXCR4(緑)、PAX7(赤)、MSX1(緑)のSca1(赤)、およびアルカリホスファターゼ。核はDAPI(青色)で染色しました。スケールバー= 10〜200ミクロン。 (b)は、多能性マーカー遺伝子、および(c)筋原性マーカー遺伝子のiMuSCsのqPCR分析。データは5生物学的複製の平均±SEMとして表されます。 (d)の懸濁液中に形成された胚様体(EB)の明視野像、および凍結切片EBの免疫蛍光染色。 EBはSox2の(赤)のOct4(緑)、およびNanog(赤)について陽性の細胞を含んでいました。核はDAPI(青色)で染色しました。スケールバー=100μmです。 (E)のqPCRデータがあるOct4、Nanogの、Sox2ののアップレギュレーションを示し、ネスチン発現の変化は、未分化iMuSCsを制御するために比較しません。 (f)は、分化したEBの免疫蛍光画像は、αSMA(赤)、βチューブリンIII(緑)を発現ブラキュリ(赤)、およびMyHCとβチューブリンIIIβ(赤)(緑)。核はDAPI(青色)で染色しました。スケールバー=100μmです。差別EBをネスチン、Mtap2、デスミン、およびミオゲニンのアップレギュレーション、およびNanogのダウンレギュレーションを示し、7日の(G)のqPCRデータは未分化iMuSCsを制御するために比較しました。すべてのqPCRデータは、デルタデルタCt法で分析し、5生物学的反復の平均±SEMとして表されます。
フルサイズのイメージ
iMuSCsの多能性を明確にするために、我々はiMuSCsシャーレで胚様体(EB)(図3d、e)を形成することができることを示したin vitroでのassays6,7分化を行いました。浮遊培養で7日後、EBを拡大し、自発的分化を開始した外胚葉と中胚葉胚葉種々の誘導体にし、さらに2週間培養した後、付属のEBは、神経のような構造に包含多核筋管を収縮を形成した(図3F 、G)。我々はさらに、in vivoで奇形腫形成によってiMuSCsの多能性を検討しました。 7週間のSCIDベージュマウス(ジャクソン研究所、米国)に移植すると、iMuSCsは(90%、N = 7)は、3つの胚葉の代表組織を含む(図4a)奇形腫を形成しました。組織学的検査はiMuSCsは、神経、筋肉、および脂肪組織、および上皮に分化することを明らかにしました。奇形腫は、移植された細胞から直接形成されたことを確認するには、iMuSCsは、注射の前にβ-galで事前に標識し、我々はLacZを(図で染色したとき奇形腫内のすべての3つの胚葉誘導体は、β-galの+細胞を含んでいた検出した。図4b )。
図4:骨格筋損傷誘発性iMuSCsは、多能性のin vivoでの基準のいくつかの果たします。
 
iMuSCsの(a)は、奇形腫形成アッセイ。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、すべての3つの胚葉の分化した構造を示した:骨格筋(中胚葉、矢印)、軟骨(中胚葉、アスタリスク)、血管(中胚葉、アスタリスク)、脂肪(中胚葉、アスタリスク)、腸上皮(内胚葉、アスタリスク)同じ試料内の、神経ロゼット(外胚葉、矢印)、および神経上皮(外胚葉、アスタリスク)。 (b)はLacZ染色は、脂肪、筋肉のLacZを予め標識iMuSC分化構造を示し、神経ロゼットは、β-galの+信号(ダークブルードット)が含まれています。スケールバー=100μmです。マウス胚発生にiMuSCsの(c)に貢献。 E14での胚をGFPおよびLacZ染色、(d)で、通常と異常に開発された胚におけるGFPおよびLacZマーカー遺伝子発現の定量PCR分析によって分析しました。 (e)のE14胚を切断し、抗GFP抗体(濃い紫色)で染色しました。細胞をエオシンで対比染色した(ピンク):皮膚やアンダー皮膚、心臓、肺、軟骨、消化管、および神経管。スケールバー=200μmです。生まれP21白い子犬におけるGFPおよびLacZマーカー遺伝子発現の(f)は、qPCR分析。データは、6匹の子から一緒に引っ張りました。
フルサイズのイメージ
iMuSCsはキメラマウスを生じさせることができるかどうかを評価するために、胚盤胞注入アッセイを行った(図4c)。我々は、単一の細胞intoBALB / C(ジャクソン研究所、米国)標準procedures8以下のマイクロインジェクションによって胚盤胞として未分化のβ-gal +およびGFP-予め標識iMuSCsを移しました。我々は、6が適切に開発され、胚にGFP + iMuSCsの寄与を示し、E14で8胚を得ました。 β-galおよびGFP発現細胞の高〜中程度の貢献は、これらのE14のキメラ胚(図4c、dおよび補足図S4aでは)で見ることができました。組織学的分析は、iMuSCsはすべての3つの胚葉(図4E及び補足図S4bと)に寄与していることを確認しました。 iMuSCs注入した胚盤胞由来子孫が生まれ、正常に開発されました。この実験を3回繰り返した後、私たちは白衣(補足表S1)を持って生まれた23匹の子、すべてを得ました。自分の髪がiMuSCsが表示されませんでしたが、生殖系列伝達、免疫染色およびqPCR分析は、図(例えば、皮膚、筋肉、心臓、肺、腎臓、脾臓、および脳などの仔のいくつかの組織でのLacZ +およびGFP + iMuSCsの存在を明らかにした。4Fと補足図ステップS4c)。
ディスカッション
矛盾した結果が、様々なgroups9,10,11,12,13,14,15によって報告されているので、成体組織における多能性細胞様細胞の存在は、年間の論争の種となっています。しかし、研究は、これまで、そのような多能性幹細胞は、分化した体細胞組織から生じ得ることを証明していません。本研究では、細胞の再プログラミングは、骨格筋が負傷したときに発生し、強い刺激によって開始され得ることを明らかにする。このように、我々が負傷骨格筋から再プログラムさiMuSCsを単離することができました。
まとめると、我々の知見は、iMuSCsこれまで研究されたすべての細胞型とは異なる特性(形態、大きさ、および遺伝子発現プロフィール)を有する細胞のユニークな、非常に敏感な集団であることを示しています。 IMuSCsはESCの代表的ないくつかの特徴を表示する(細胞質の狭い縁に囲まれた例えば大型核、高い核/細胞質比、開いたクロマチン、非構造化核質、及び染色体の二倍体数)(表1)だけでなく、いくつかの多能性を表現するだけでなく、マーカー遺伝子は、筋原性遺伝子の高い発現レベルを維持します。また、本研究の最も注目すべき発見はiMuSCsは、in vitroおよびin vivoでの多能性のための基準のいくつかの成就ということでした。しかし、我々は、胚盤胞のマイクロインジェクション後に生殖系列伝達とiMuSCsを得ることができませんでした。これはiMuSCsは、多能性マーカーの低い遺伝子発現プロファイル(例えば、あるOct4、Nanogの、及びSox2の)を有するとのESCと比較した場合、ESG1及びDAX1発現を欠いているという事実に起因し得ます。それはiMuSCsによってのBlimp1の比較的高い発現、Fragilisand筋原性マーカー遺伝子には、この観察に寄与し得ることももっともらしいです。これらの結果は、iMuSCsが多能性を完全に退行し、おそらく彼らの筋原組織起源のエピジェネティックな記憶を保持していないことを示しています。このようなDNAメチラーゼまたはNanogの過剰発現の阻害などiMuSCsのさらなる操作は、潜在的に完全な多能性を達成するためにiMuSCsをプッシュすることができます。
表1:共有特性とのESCとiMuSCsとの違い。
フルサイズ表
したがって、我々の研究の主要な結論は、このような傷害と骨格筋のような微小環境要因の変化は、部分的に多能性のような状態に最終的に分化した細胞を再プログラム筋原ことができるということです。
メソッド
動物実験
動物実験および全ての実験プロトコルは、ヒューストンのテキサス健康科学センターの大学の実験動物医学と介護センター(:AWC-13から134プロトコルはありません)によって承認されました。すべてのメソッドは、承認され、関連するガイドラインおよび規制に準拠して行われました。本研究で利用マウス系統:C57BL / 6J、BALB / C、SCIDベージュ、およびMDX / SCIDはジャクソン研究所、米国から購入しました。
細胞単離およびメンテナンス
制御MuSCsは無傷のTA筋から単離されたが、4日裂傷損傷後のマウス;(ジャクソン・ラボ、米国3-8週齢の雌)マウスiMuSCsをC57BL / 6Jの怪我のTA筋から単離しました。 iMuSCsは、3週間、12ウェル組織培養プレート(Corning、USA)にESGRO完全PLUSクローングレード培地(Millipore社、USA)で別々に培養しました。正確な化学株式会社、培地は、通常、筋肉の増殖培地で[ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、20%ウシ胎児血清(FBS)を補充した、10%ウマ血清(HS)、1%ニワトリ胚抽出物(CEEを交換しましたUK)、及び1%ペニシリン - ストレプトマイシン抗生物質。特に断らない限り、全てGibco社、USA]及びiMuSCsからさらに培養し、37℃で5%CO 2でコラーゲンIV型でコーティングしたフラスコに拡大しました。そしてMuSCs(ATTC、USAから購入)C2C12初代マウス筋芽細胞を対照として用い、37℃で5%のCO2で増殖培地中のコラーゲンIV型でコーティングしたフラスコで培養しました。 iMuSCsの特性は、インビトロおよびインビボアッセイ標準を適用することにより行いました。
キメラマウスの作製と解析
β-gal-およびGFP-予め標識iMuSCsの未分化単一細胞は、標準的なprocedures8以下のマイクロインジェクションにより、BALB / cマウスの胚盤胞(ジャクソン研究所、米国)に移しました。妊娠したマウスを屠殺し、E14の胚を回収し、脱水し30、20および10%ショ糖の連続希釈をし、次いで4%パラホルムアルデヒド(Sigma社、USA)中で固定し、パラフィンに包埋しました。切片をエオシンで対比染色し、蛍光顕微鏡(ニコン)によって可視化し、抗GFP抗体を用いて染色しました。
テラトーマ形成アッセイ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に2×106細胞/ ml - IMuSCsは1で懸濁しました。 SCIDベージュマウス(ジャクソン研究所、米国)をジエチルエーテルで麻酔し、背側腹部に細胞懸濁液を皮下に500μlのを注射しました。 7週間細胞注射後、腫瘍が外科的にマウスから解剖しました。サンプルを4%ホルムアルデヒドで固定し、計量し、そしてパラフィン中に包埋しました。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。
試験管内分化に
インビトロで胚様体(EB)にiMuSCsの形成は、日常的に使用される「ハンギングドロップ」technique6,16を印加することによって誘導しました。 iMuSCsの単一細胞懸濁液(3.75×104細胞/ ml)を100mm皿の蓋にESGROコンプリートプラスクローングレードミディアム(ミリポア、USA)の20μlのマイクロ滴として配置しました。皿の底板は、試料の乾燥を避けるために、滅菌PBSで満たしました。蓋はドロップ培養を達成するためにぶら下げ4日間ボトムプレート上に置きました。この間、単一iMuSCsを回収し、さらに3日間懸濁液中でさらに培養したEBSを、形成されました。自発的なインビトロ分化のために、EBをEB培地[DMEM、20%FBS、2mMのグルタマックス、1%非必須アミノ酸、および1%抗生物質を補充におけるIV型コラーゲンでコーティングした24ウェルプレート上で培養しました。すべてギブコ(米国)]から培地で2週間、一日おきに変更。さらに、iMuSCs複数の微分は、標準protocols5,17,18を以下筋および骨形成分化アッセイによって評価しました。
焦がす細胞遊走
標的細胞集団と対照細胞(MuSCsおよびC2C12細胞)を48時間前に、時間経過実験を、増殖培地中に、10,000細胞/ウェルで、IV型コラーゲンでコーティングした6ウェルプレート上に別々に播種しました。タイムラプス画像は、顕微鏡筐体(精密プラスチック、USA)を装着したオリンパスIX-81(オリンパス、米国)顕微鏡上アンドールIXon3 885 EMCCDカメラ(アンドール、米国)で取得し、単一細胞遊走の画像がために採取しました3分間隔で6時間。三つの異なるフィールド/ウェルの記録のために選択しました。適切な環境条件は、5%のCO 2、37℃でマイクロインキュベーター中で維持しました。一連の画像は、(細胞体の表現であると仮定された)細胞核の重心位置(x、y)を追跡するために、NIH ImageJの解析ソフトウェアを用いて分析しました。移行パスはIbidiから走化性および移行ツールV2.0でプロットし、分析しました。正味移行距離を起点と6時間後に、細胞のエンドポイントとの間の距離として測定しました。移動速度は6時間の間に移動経路の長さの合計として算出しました。
免疫組織化学
サンプルを室温で20分間、4%パラホルムアルデヒド(Sigma社、USA)で固定しました。 30分間、0.2%トリトンX-100(Sigma社、USA)を用いて透過処理した後、抗体の非特異的結合は、室温で、PBS中10%BSAおよび5%HS(Sigma社、USA)で1時間ブロッキングしました。一次抗体(補足表2)を4℃で一晩適用しました。一晩のインキュベーション後、細胞を適切な蛍光結合二次抗体(拡張データ表2)を用いて室温で1時間インキュベートしました。核は4 '、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色(Sigma社、USA)を用いて明らかにし、蛍光顕微鏡(ニコン)は、結果を視覚化するために使用されました。定量的画像解析をNIH ImageJのソフトウェアを用いて行きました。
核型分析
核型は、テキサス州の小児病院細胞遺伝学コア・ラボ、米国テキサス州ヒューストンでの従来のGバンディング分析を用いて決定しました。
アルカリホスファターゼのアッセイおよび組織化学的染色集団倍加
培養物の増殖を推定するために、標準的なプロトコルは、集団倍加のアッセイのために行きました。簡単に説明すると、5000 iMuSCsは4日間増殖培地中のコラーゲンIV型でコーティングした6ウェルプレート上にプレーティングした、毎日よくコンテンツを収集し、計数しました。おおよその集団倍加時間(PDT)のように決定した:ここで、tは時間(24時間)=、N0 =初期細胞数、Ntを=時間における細胞数。
アルカリホスファターゼ活性についての組織学的染色は、製造業者の説明書に従って市販のキット(Sigma-Aldrich社、USA)を用いて行きました。
定量的リアルタイムPCR
トータルRNAをRNeasyプラスミニキット(キアゲン、USA)を用いて単離し、そしてcDNAを、製造業者の指示に従ってRNA対のcDNAキット(Life Technologies社、USA)高容量を介してRNAを1μgから合成しました。遺伝子発現はMyiQリアルタイムPCRシステム(Bio-Rad社、USA)を用いて定量的リアルタイムPCR(定量PCR)によって分析しました。適用プライマー(補足表3)は、オリゴソフトウェア(オリゴパーフェクトデザイナー、Invitrogen、米国)によって設計されました。反応はホットスタートジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ酵素(Sigma社、USA)に基づくカスタム2×SYBERグリーンマスターミックスを用いて、二重に測定しました。増幅は、40サイクル(95℃20秒、60℃20秒、72℃40秒)のために行われました。 PCR産物を確認するために、融解曲線および陰性対照を各反応で行いました。 mRNAの相対定量を基準として、対応する対照試料の発現プロファイルを使用して、ΔΔCT法(2-ΔΔCT式)19によって決定しました。
データ処理及び統計的分析
プリズム6.0(グラフパッドソフトウェア、USA)を、非線形回帰と統計的分析をプロットするデータのために使用しました。データは±S.E.M.意味として与えられます両群間の比較は、スチューデントの両側分布を仮定し、t検定、および不等分散を用いて行きました。多重比較のために、ANOVAまたはクラスカル・ワリス検定を適用しました。統計的有意性は、p <0.05であると考えられました。
追加情報
Vojnits、K.ら:この記事を引用する方法。筋肉由来の幹細胞様細胞の損傷誘発人口のキャラクタリゼーション。サイエンス。議員5、17355。 DOI:10.1038 / srep17355(2015)。
参考文献
1. 1。
Ceafalan、LC、ポペスク、BO&Hinescu、骨格筋再生におけるME携帯プレーヤー。 BIOMED RESのInt 2014、957014(2014)。


3. 2015年12月13日 12:41:04 : jXbiWWJBCA : zikAgAsyVVk[137]

分化した筋細胞由来ではなく、単に、既存のStemCellが傷害によって刺激されて移動・増殖して発見されただけという可能性が完全に否定されるか疑問。



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